г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5 (499) 135-99-57 info@ckpgene.ru
Главная / Спектрофотометрия

Спектрофотометрия.

Спектрофотометрия, метод исследования и анализа веществ, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. Иногда под спектрофотометрией понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагнитного излучения), фотометрию и спектрометрию (как теорию и практику измерения соотв. интенсивности и длины волны (или частоты) электромагнитного излучения); на практике спектрофотометрию часто отождествляют с оптической спектроскопией.

Применение спектрофотометрии в УФ и видимой областях спектра основано на поглощении электромагн. излучения соединениями, содержащими хромофорные (напр., С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН3, ОН, NH2 и др.) группы. Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов s-, p-и n-орбиталей осн. состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: s : s*, n : s*, p : p* и n : p*. Переходы s : s* находятся в далекой УФ области, напр. у парафинов при ~ 120 нм. Переходы n : s* наблюдаются в УФ области; напр., орг. соед., содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N, Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине волны ок. 200 нм. Линии, соответствующие переходам p : p*, напр., в спектрах гетероциклич. соединений проявляются в области ок. 250-300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n : p*, находятся в ближней УФ и видимой областях спектра; они характерны для соед., в молекулах к-рых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщ. альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны ок. 285 нм. Переходы типа n : p* часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.

Переходы типа p : p* могут сопровождаться переходом электрона с орбитали, локализованной гл. обр. на одной группе (напр., С=С), на орбиталь, локализованную на др. группе (напр., С=О). Такие переходы сопровождаются переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры наз. спектрами с переносом заряда. Последние характерны для разл. комплексов (напр., ароматических соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.

Таким образом, спектр поглощения объекта зависит от его молекулярного состава, что дает широкие возможности для качественного и количественного определения различных веществ.

Закон Бугера-Ламберта-Бера — основной закон, описывающий поглощение света средой. Он связывает между собой  интенсивности Il света, прошедшего слой среды толщиной l, и исходного светового потока I0.

где показатель поглощения вещества. Для растворов поглощающих веществ в непоглощающих растворителях показатель поглощения может быть записан как

где коэффициент, характеризующий взаимодействие молекулы поглощающего вещества со светом длины волны λ, C — концентрация растворённого вещества.

Следует отметить, что наблюдаются многочисленные отклонения от этого закона, особенно в случае больших концентраций. Так в случаях высокой концентрации поглощающего вещества в растворе или его неравномерного распределения по объему может наблюдаться так называемый «эффект сита», когда одна часть поглощающих  частиц начинает экранировать другие. Также отклонения от закона Бугера могут наблюдаться в случае световых потоков очень высокой интенсивности. Это связано с тем, что очень большая доля поглощающих частиц, перейдя в возбуждённое состояние и оставаясь в нём сравнительно долго, меняет (или совсем теряет) способность поглощать свет, что, разумеется, заметно изменяет характер поглощения света средой.

Спектрофотометры.

Устройство спектрофотометров и их характеристики могут значительно отличаться в зависимости от производителя и задач, для решения которых рассчитан прибор. Однако основные элементы конструкции у всех приборов сходны. Это источник света, монохроматор, кюветное отделение с образцом и регистрирующего детектора. В качестве источника света чаще всего используются ртутные или галогеновые лампы. Монохроматор — устройство для выделения из всего излучаемого спектра какой-то узкой его части (1-2 нм). Монохроматоры могут быть построены на основе разделяющих свет призм либо на основе дифракционной решетки. Также в некоторых приборах могут дополнительно применяться наборы светофильтров. Кюветное отделение может быть оборудовано механизмами для термостатирования, перемешивания, добавления вешеств непоспедственно в ходе процесса измерения. Для исследований малых объемов веществ может использоваться безкюветная технология, когда образец удерживается за счет сил поверхностного натяжения жидкости.