Методики.

Лизис эритроцитов и окраска антителами поверхностных антигенов для исследования на проточном цитометре.

Лизирующий раствор:
NH4Cl - 1.652 g
NaHCO3 - 0.200 g
EDTA - 0.076 g
H2O - 200 ml

1. К 10мл лизирующего раствора добавить 350мкл образца (кровь, костный мозг), инкубировать при комнатной температуре 7-10 мин (не более 10 мин).
2. Добавить 5 мл р-ра Версена или PBS (остановка лизиса). Центрифугировать 7-10 мин при комнатной температуре, 300g. Слить надосадок.
3. Еще два раза отмыть суспензию р-ром Версена или PBS при тех же условиях. Полученную суспензию разнести по цитометрическим пробиркам.
4. Добавить к суспензии моноклональные антитела (объем и условия инкубации согласно методике производителя)
5. Отмыть суспензию р-ром Версена или PBS (7-10 мин, RT, 300g)
6. Добавить 300-400 мл 1% р-ра формальдегида или его коммерческого аналога (IOTest 3 Fixative Solution и т.п.). Готовые образцы хранятся в холодильнике (до 24 часов). Если окрашиваемые поверхностные молекулы могут быть чувствительны к воздействию формальдегида, то вместо него следует добавить аналогичный объем раствора Версена или PBS, и в этом случае измерение на цитометре необходимо провесте в течении трех часов после окрашивания.

Окраска внутриклеточных антигенов для исследования на проточном цитометре.

Сапониновый пермеабилизирующий буфер(готовится на PBS):
0,1% сапонин
0,1% БСА
0,1% NaN3

1. В подписанные цитометрические пробирки добавить по 50 мкл р-ра Версена и по 50 мкл образца (кровь, костный мозг). Если требуется одновременное окрашивание поверхностных маркеров клеток добавить антитела к ним (объем и условия инкубации согласно методике производителя).
2. Добавить 1мл 2% р-ра формальдегида. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре в темном месте.
3. Отмыть р-ром Версена или  PBS (7-10 мин, RT, 300g)
4. Добавить 1 мл сапонинового буфера. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре в темном месте. Центрифугировать 70-10 мин при комнатной температуре, 300g. Слить надосадок.
5. Добавить антитела к внутриклеточным антигенам объем и условия инкубации согласно методике производителя).
6. Отмыть 2 мл сапонинового буфера (7-10 мин, RT, 300g), добавить по 300-400мкл % р-ра формальдегида или его коммерческого аналога (IOTest 3 Fixative Solution и т.п.). Готовые образцы хранятся в холодильнике до 24 часов.

Ссылки
http://molbiol.ru/protocol/ - распространенные методики в молекулярной биологии
http://www.sci.sdsu.edu/classes/chemistry/chem467l/mardahl/ - сборник методик от Dr. Michelle Mardahl
http://www.molecularstation.com/protocol-links/Cell-Biology-Cell-Culture/Cell_Culture_Techniques/ - сборник методик по клеточным технологиям
http://www.protocol-online.org/ - сайт-сборник различных лабораторных методик
http://biowww.net/browse-33.html — методики и протоколы для культивирования клеток
Методическое пособие ЦКП ИБГ РАН 2013